研究背景：克雷伯氏肺炎桿菌是一種廣泛存在于醫院環境中的致病菌，它能夠引起包括肺炎在內的多種嚴重感染，尤其在免疫力低下的患者中更是致命的威脅。隨著抗生素耐藥性的不斷增加，快速準確地診斷克雷伯氏肺炎桿菌感染變得尤為重要，這對于指導臨床合理使用抗生素、控制感染的傳播、減少醫療成本以及提高患者生存率都有顯著影響。而傳統的實驗室檢測方法耗時或需昂貴的儀器和熟練的操作員，限制了在臨床即時快速檢測方面的應用。基于 CRISPR的檢測方法逐漸發展，具有高靈敏度、方便快捷的優點。近期，北京化工大學史碩博教授等構建了一種用于樣品提取的快速室溫前處理方法，并改進了基于 Cas12a 的技術，以開發一種免提取的一鍋法病原體檢測方法，并在Biosensors and Bioelectronics上進行發表。
EXORCA檢測流程：
該檢測試劑盒只需兩個步驟即可檢測臨床樣品：快速預處理（約1 min）和 RPA/Cas12a 檢測（約30 min）。預處理主要是將裂解液與樣本呢混勻。隨后，混合物直接進行 RPA/Cas12a 檢測。使用次優 PAM 的 crRNA 由于 Cas12a 的活性降低而具有較慢的 CRISPR 檢測動力學，從而使反應偏向等溫擴增。隨后，RPA 產生足夠的擴增子，可以被 Cas12a/crRNA 二元復合物識別，這反過來促進 Cas12a 的反式切割反應。這種活性導致 ssDNA 熒光探針的切割，從猝滅劑中分離熒光團，從而發射熒光信號。
檢測效果：
如下圖所示，通過熒光讀數器獲取結果的方法的檢測范圍在10-1-10-7CFU/μL，而通過肉眼直接在藍光下觀察獲取檢測結果的方法的檢出限大概在10-1CFU/μL 。而且該檢測方法具有良好的特異性，對于不同的克雷伯氏肺炎桿菌均能達到較好的響應，而對于非克雷伯氏肺炎桿菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌等常見的致病菌），均呈現陰性結果。并且研究人員設計了這幾種菌的 crRNA 序列使用EXORCA的方法進行檢測，均得到了較好的檢測結果。這些結果說明了該方法具有良好的靈敏度、特異性、便捷性等優點，對于臨床即時檢測提供了新方法和新思路。
論文來源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116740
來源：微生物安全與健康網，作者~賀鵬霖。
