GB4789.3-2016大腸菌群平板計數法細節解讀
發布時間：2019-10-31 瀏覽次數：17881
1.所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無污漬、無殘留，且晾干無水漬。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般用錫箔紙覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基。在傾注培養基時，須點燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
2.如何保持培養基“煮沸2min”？
答：培養基加熱煮沸至完全溶解一般采用電陶爐或電熱爐進行，但培養基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養基很快上涌、翻騰，若不調低溫度或立刻采取其他措施，則培養基可在數秒內噴涌出來，嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內都是培養基飛濺的范圍（實驗室危險因子之一）。因此，要做到“煮沸2min”，則需在該培養基即將煮沸時調低溫度，待培養基一沸騰就馬上移離熱源，待培養基停止沸騰后，又繼續加熱至沸騰狀態又移開，這樣間歇性煮沸2min。（注意規范操作，做好防燙措施，避免燙傷）
3.若培養基未用完，是否可以冷藏起來下次用？
答：不可以。4789.28中已規定，固體培養基最多允許熔融1次（指的是經過高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養基冷卻后，再次熔融時非常容易噴涌，若溫度控制不當，底部培養基熔融后很快就會發生噴涌。
4.傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：需要覆蓋。因為培養基冷卻后在表面容易形成一些冷凝水，菌落容易蔓延開，所以在傾注完成后，再覆蓋一層培養基，則菌落不容易接觸到水，這樣不易形成蔓延菌落。在檢驗中最好都進行覆蓋，最好是在原培養基已凝固或半凝固（不會發生晃動）時再傾注一層培養基（“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個平皿）。
二、如何確定培養基上長的是不是大腸菌群？
答：不要去管什么是大腸菌群的典型形態，建議新手們認真按照標準進行證實試驗，此證實試驗非常簡單，每一次VRBA上有菌落生長都進行證實試驗，如此往復3-4次，對于哪種形態才是大腸菌群已經能夠了然于心了。建議平時多配一些BGLB肉湯管冷藏儲存備用，需要進行證實試驗時分分鐘可以完成試驗。
三、兩個梯度都長了菌，如何選取？如何進行證實試驗？菌落選取數量？
答：選取15-150CFU之間的平板（指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍），挑取可疑菌落進行證實試驗。詳細舉例說明：若有兩個連續梯度的4個平板上菌落數均在15-150之間，則4個平板上的菌落都要挑取進行證實試驗，實際操作時，可靈活操作，如：1:10的兩個平板上的菌落數分別為120、123，1:100的兩個平板的菌落數分別為16、18，嚴格來講必須至少在每個平板上分別挑取5個可疑菌落、5個典型菌落進行證實試驗。建議使用鎳合金接種環（即傳統的接種環，而不是一次性塑料接種環），因為VRBA上生長的菌落（無論典型或可疑）大部分長在底層、且菌落一般較大，被培養基覆蓋，傳統的接種環較細，用以刮去上層培養基較方便，挑取菌落也較方便。
確證試驗注意：1）.每種可疑菌落挑取5個，每個菌落放入1管GBLB管中；2）“產氣者，記為大腸菌群陽性管”，就要求在實驗前須認真篩選BGLB管，凡小導管中有氣泡的GBLB管應先排去導管中的氣泡再使用。
VRAB平板上典型大腸菌群菌落形態
BGLB確證陽性結果
四、結果如何計算？
答：首先，在VRBA培養24h后進行計數，分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群的數量。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100*6/10*104/g（mL）=6.0*105 CFU/g（mL）。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
五、若所選適合計數梯度平板上可疑和典型菌落，最終證實全部為陰性，結果如何計算？
答：根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進行證實試驗，若證實全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落（建議可疑和典型菌落分別挑取10個）進行證實試驗，若第二次證實試驗均呈陰性，以＜1乘以最低稀釋度進行計算，如：1:10的平板菌落數分別為120、123，1:100的平板上菌落數分別為16、18，首先挑取1:100的兩個平板上的菌落進行證實試驗，若全部為陰性，再挑取1:10的兩個平板上的菌落進行證實試驗，若1:10的平板上的菌落數證實為陰性，則最終計算過程為＜1x10，最終結果為＜10；若1:10的的平板上的菌落有陽性管，則按照第5條進行計算。
