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【學習筆記】GB 5749生活飲用水微生物指標——菌落總數解讀

發布時間：2024-02-21 瀏覽次數：5144

GB5749-2022 規定的常規檢驗微生物指標共3項，總大腸菌群、大腸埃希氏菌、菌落總數。

其中水中菌落總數可作為評價水質清潔程度和考核凈化效果；大腸菌群指示水體是否存在腸道傳染病的可能性。
總大腸菌群主要包括4個菌屬：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營養豐富的水體中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出這些細菌的可能性。耐熱大腸菌群和總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關的僅有一個種，即大腸埃希氏菌。檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義最大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的衛生學意義稍遜一些。

PART.1 檢測依據

1、GB/T 5750.2-2023《生活飲用水標準檢驗方法第2部分：水樣的采集與保存》
2、GB/T 5750.12-2023《生活飲用水標準檢驗方法第12部分：微生物指標》

PART.2 水樣采集

一、采樣容器：潔凈磨口硬質玻璃瓶；潔凈聚乙烯瓶（桶或袋）；也可以使用符合要求的一次性采樣袋或采樣瓶。

二、采樣容器的洗滌

1. 容器洗滌：將容器用自來水和洗滌劑洗滌，并用自來水徹底沖洗后用質量分數為10%的硝酸（或鹽酸）浸泡8h以上，然后依次用自來水和純水洗凈。
2. 容器滅菌：可采用干熱或高壓蒸汽滅菌兩種。干熱滅菌要求160℃下維持2h；高壓蒸汽滅菌要求121℃下維持15min，高壓蒸汽滅菌后的容器如不立即使用，應置于60℃烘箱內將瓶內冷凝水烘干。滅菌后的容器應在2周內使用。

三、采樣要求

1. 無菌操作。
2. 不應用水樣蕩洗已滅菌的采樣瓶或采樣袋。
3. 避免手指和其他物品對瓶口或袋口的玷污。
4. 自來水水樣：先將水龍頭用火焰燒灼3min滅菌再開放水龍頭使水流5min（經常用水的水龍頭放水1-3min）后，采集水樣。
5. 水源水水樣：選有代表性的地點及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采樣后在水中蓋好蓋子，再從水中取出。
6. 從速送檢，在0~4℃下保存，水樣從采集到檢驗不應超過8h。

PART.3.1 項目測定：菌落總數

一、概念

1. 菌落：指細菌在固體培養基上發育而形成的能被肉眼所識別的生長物，它是由數以萬計的相同細菌聚集而成的，故又有細菌集落之稱。
2. 菌落總數：在一定條件下，經一定時間培養后所得1mL水樣中微生物菌落個數。

二、意義

1. 水中菌落總數可作為評價水質清潔程度和考核凈化效果的指標。
2. 菌落總數增多說明水體已被污染，但不能說明污染來源，也不能說明該水體傳播傳染病的風險程度。因此，必須結合總大腸菌群來判斷水質污染的來源和安全程度。

三、測定方法 —— 平皿計數法

1. 原理：1mL水樣在營養瓊脂培養基上、在有氧條件下36℃±1℃培養48h后，所得1mL水樣中的菌落總數的方法。

2. 營養瓊脂培養基
成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化鈉5g；瓊脂10~20g；純水1000mL
制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調整pH為7.4~7.6，分裝于玻璃容器中，經121℃高壓蒸汽滅菌20min，0~4℃冷藏保存。

3. 實驗步驟

生活飲用水：
① 以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入無菌平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻，每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養瓊脂培養基作為空白對照。
② 待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養箱內培養48h±2h，進行菌落計數，即為1mL水樣中的菌落總數。

水源水：
① 以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：10稀釋液；
② 用無菌吸管或移液器吸取1：10的稀釋液1mL注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：100稀釋液；
③ 按同法依次稀釋成1：1000、1：10000等稀釋度的液體備用。每稀釋一個稀釋度，應更換一次1mL無菌吸管或吸頭。
④ 用無菌吸管或移液器吸取2個~3個適宜稀釋度的水樣1mL，分別注入無菌平皿內。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。

4. 實驗數據處理

結果報告：可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。

同一稀釋度，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數；若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落數分布又很均勻，則可將此半皿計數后×2以代表全皿菌落數。然后再求得該稀釋度的平均菌落數。

不同稀釋度的選擇及報告方法，見下表。

四、測定方法——酶底物法

1. 原理：利用復合酶技術，在培養基中加入多種獨特的酶底物，每一種酶底物都針對不同的細菌酶設計，且包含最常見的介水傳播的細菌，所有的酶底物在被分解時均產生相同的信號。水樣檢測過程中，水樣中存在的細菌分解一種或者多種酶底物，之后產生一個相同的信號，在檢測菌落總數時，這個信號即為在波長366 nm紫外燈下所產生的熒光。使用基于復合酶底物技術(Multiple Enzyme Technology)的培養基，其中酶底物被微生物的酶水解，在36℃±1℃下培養48 h后能夠最大限度地釋放4-甲基傘形酮，4-甲基傘形酮在366 nm紫外燈照射下發出藍色熒光，對呈現藍色熒光的培養盤孔槽計數并查閱MPN表，可以確定原始水樣中最可能的菌落總數。

本方法未稀釋水樣的檢測范圍為<738 MPN/mL。

2. 復合酶底物培養基

成分：a)葡萄糖 1.25g、b)無水硫酸鎂 0.2g、c)蛋白胨 5.0g、d)酵母提取物 3.5g、e)4-甲基傘形酮磷酸酯 0.0375g、f)4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷 0.03g、g)純水 1000mL。

制法：將上述成分溶解于純水中，調整pH為6.7～7.3，經0.22um濾膜過濾除菌。制備好的培養基于2℃~8℃條件下保存備用。

3. 實驗步驟

水樣稀釋：檢測所需水樣為1 mL。若水樣污染嚴重，可對水樣進行稀釋。以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1 mL充分混勻的水樣，注入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩混勻后取1 mL進行檢測，必要時可加大稀釋度，以10倍逐級稀釋。

接種培養：
① 向一無菌試管中加入9 ml制備好的液體培養基；如選用符合要求的成品培養基，則向裝有0.1 g培養基的試管中加入9 mL無菌生理鹽水。取1 mL水樣加入上述試管中，渦旋振蕩混勻。
② 將混勻后的水樣倒入培養盤中心位置，將培養盤蓋好，放置在水平桌面上，緊貼桌面順時針輕柔晃動培養盤，將待測水樣分配到培養盤的所有孔槽中。
③ 將培養盤90°~120°豎起，使多余的水樣由盤內海綿條吸收，將培養盤緩慢翻轉過來，倒置放于36 ℃±1℃培養箱中，培養48 h。可疊放培養，不宜超過10層。

4. 實驗數據處理

結果計數：將培養后的培養盤取出，倒置于暗處或紫外燈箱內，在6 W 366 nm紫外燈下約13 cm處觀察，記錄產生藍色熒光的孔數。如未放置在紫外燈箱內，觀察時需佩戴防紫外線的護目鏡。培養盤中的84個孔，無論熒光強弱，只要呈現藍色熒光即為陽性，但海綿條的熒光不計入結果。