【學習筆記】GB 5749生活飲用水微生物指標——總大腸菌群
發布時間：2024-02-28 瀏覽次數：11631
GB5749-2022 規定的常規檢驗微生物指標共3項，總大腸菌群、大腸埃希氏菌、菌落總數。
其中水中菌落總數可作為評價水質清潔程度和考核凈化效果；大腸菌群指示水體是否存在腸道傳染病的可能性。
總大腸菌群主要包括4個菌屬：埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，有的也可以在營養豐富的水體中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出這些細菌的可能性。耐熱大腸菌群和總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關的僅有一個種，即大腸埃希氏菌。檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義最大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的衛生學意義稍遜一些。
PART.1 檢測依據
1、GB/T 5750.2-2023《生活飲用水標準檢驗方法 第2部分：水樣的采集與保存》
2、GB/T 5750.12-2023《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分：微生物指標》
PART.2 水樣采集
一、采樣容器：潔凈磨口硬質玻璃瓶；潔凈聚乙烯瓶（桶或袋）；也可以使用符合要求的一次性采樣袋或采樣瓶。
二、采樣容器的洗滌
1. 容器洗滌：將容器用自來水和洗滌劑洗滌，并用自來水徹底沖洗后用質量分數為10%的硝酸（或鹽酸）浸泡8h以上，然后依次用自來水和純水洗凈。
2. 容器滅菌：可采用干熱或高壓蒸汽滅菌兩種。干熱滅菌要求160℃下維持2h；高壓蒸汽滅菌要求121℃下維持15min，高壓蒸汽滅菌后的容器如不立即使用，應置于60℃烘箱內將瓶內冷凝水烘干。滅菌后的容器應在2周內使用。
三、采樣要求
1. 無菌操作。
2. 不應用水樣蕩洗已滅菌的采樣瓶或采樣袋 。
3. 避免手指和其他物品對瓶口或袋口的玷污。
4. 自來水水樣：先將水龍頭用火焰燒灼3min滅菌再開放水龍頭使水流5min（經常用水的水龍頭放水1-3min）后，采集水樣。
5. 水源水水樣：選有代表性的地點及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采樣后在水中蓋好蓋子，再從水中取出。
6. 從速送檢，在0~4℃下保存，水樣從采集到檢驗不應超過8h。
PART.3.2 項目測定：總大腸菌群
一、概念
1. 一群在37℃培養，24h內能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括埃希氏菌屬、檸檬酸細菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬。
2. 飲用水中的總大腸菌群主要是指大腸桿菌、大腸菌群和糞大腸菌群三大類型細菌共同組成的大腸菌群。
二、意義
1. 總大腸菌群主要來自人和溫血動物糞便，還可能來自植物和土壤。
2. 由于其數量大，在體外存活時間與腸道致病菌相似，且檢驗方法比較簡便，故被作為檢驗腸道致病菌的指示菌。
3. 水中大腸菌群數的多少，表明水體被糞便污染的程度，并間接地表明有腸道傳染病菌存在的可能性，但它不是專一的指示菌。
4. 如果在水樣中檢出總大腸菌群，則應再檢驗大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群以證明水體是否已經受到糞便污染；如果水樣中沒有檢出總大腸菌群，就不必再檢驗大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌群。
三、測定方法 —— 多管發酵法
1. 原理：經36℃±1℃培養24h，發酵乳糖產酸產氣，經證實實驗和革蘭氏染色檢測水中總大腸菌群的方法。
2. 培養液與培養基
2.1 乳糖蛋白胨培養液
成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；乳糖5g；氯化鈉5g；溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L）1mL；純水1000mL（二倍濃縮乳糖蛋白胨培養液純水500mL）。
制法：將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于純水中，調整pH為7.2~7.4，再加入1mL溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻。分裝于裝有小倒管的試管中，經115℃高壓蒸汽滅菌20min后，于0~4℃冷藏避光保存。
2.2 伊紅美藍培養基
成分：蛋白胨10g；乳糖10g；磷酸氫二鉀2g；瓊脂20~30g；純水1000mL；伊紅水溶液（20g/L）20mL；美藍水溶液（5g/L）13mL。
制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于純水中，校正pH為7.2，加入乳糖，混勻后分裝，經115℃高壓蒸汽滅菌20min。臨用時加熱融化瓊脂，冷至50~55℃，加入伊紅和美藍水溶液，混勻，傾注平皿。
3. 實驗步驟
乳糖發酵試驗：
① 用無菌吸管或移液器吸取 10 mL水樣接種到10 mL雙料乳糖蛋白胨培養液中，取1 mL水樣接種到10 mL單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1 mL水樣注入到9 mL無菌生理鹽水中，混勻后取1 mL(即0.1 mL水樣）注入到10 mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管；
② 對已處理過的出廠自來水，需經常檢驗或每天檢驗一次的，可直接接種5份 10mL水樣接種10mL雙料培養基，每份接種10 mL水樣。
③ 檢驗水源水時，如污染較嚴重，應加大稀釋度，可接種（1mL - 0.1mL - 0.01mL），甚至（0.1mL - 0.01mL - 0.001mL），每個稀釋度接種5管單料乳糖蛋白胨培養液，每個水樣共接種15管。接種1 mL以下水樣時，應作10倍遞增稀釋后，取1 mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL無菌吸管。
④ 將接種管置于36 ℃±1℃培養箱內，培養24 h±2 h，如所有乳糖蛋白胨培養管都不產氣產酸，則可報告為總大腸菌群未檢出，如有產酸產氣者，則按下列步驟進行。
分離培養：挑取符合下列特征的菌落進行革蘭氏染色鏡檢
—— 深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；
—— 紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；
—— 淡紫紅色、中心較深的菌落。
筆記：非典型菌落用不用革蘭氏染色，挑幾個菌落？標準里沒有提到，這樣會不會造成漏檢？（個人覺得可疑菌落也要挑取驗證的，GB8538里規定挑取10個典型菌落做驗證，可以做參考）
證實試驗：經上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養液，置36 ℃±l℃培養箱中培養24 h±2 h，有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在。
4. 實驗數據處理
結果報告：根據證實為總大腸菌群陽性的管數，查MNP表（根據GB/T5750.12所附檢索表），報告每100mL水樣中的總大腸菌群MNP值。稀釋樣品查表后所得結果應乘稀釋倍數。如所有乳糖發酵管均為陰性時，可報告總大腸菌群未檢出（報告與總則不一致，50mL水樣報告100mL水樣未檢出不準確）。
5. 指標限值（總大腸菌群：不應檢出MPN/100mL或CFU/100mL。）
四、其他
1. 如何殺滅飲用水中的總大腸菌群？
可通過化學消毒和煮沸殺滅飲用水中的總大腸菌群，常用的化學消毒劑是含氯制劑和二氧化氯，在日常生活中，煮沸是方便快捷的消毒方式，總大腸菌群在我省農村地區的飲用水中較為常見，因此提倡喝開水以降低和減少介水傳染病的發生和流行。
2. 相關“大腸”菌
跟“大腸”有關的微生物學或衛生學名詞有：總大腸菌群、大腸菌群、耐熱大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌、大腸桿菌、致病性大腸桿菌等等。
在上述名詞中，除了“大腸桿菌”和“大腸埃希氏菌”是細菌學名詞以外，其余幾個都是衛生細菌領域用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而是指具有某些特性的一組細菌。
總大腸菌群=大腸菌群；耐熱大腸菌群=糞大腸菌群（也有科學家認為耐熱大腸菌群的范圍大于糞大腸菌群）；大腸埃希氏菌=大腸桿菌。
按范圍大小排序：總大腸菌群（大腸菌群）>糞大腸菌群&耐熱大腸菌群>大腸桿菌（大腸埃希氏菌）>致病菌。
大腸桿菌是人和溫血動物腸道內普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染，且感染可能是致命的，尤其對老人和小孩！這些侵入人體部位能導致腹瀉、嘔吐等癥狀的，則稱為致病性大腸桿菌。
說明：環凱轉載于“ 食品微生物檢測”公眾號，內容版權屬于歸原作者所有（a萌記邊學邊記根據相關國標整理，編輯：食品小測，審核：小匯；）；
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