微生物質控菌種復蘇、保藏、使用及管理
發布時間：2019-10-11 瀏覽次數：17151
微生物實驗室如果從事致病菌檢測、培養基質控驗收、方法驗證等相關工作，就應該備有質控菌株。實驗室需對使用的質控菌株進行規范性管理，以便有效地、安全地使用，保證實驗結果的準確性，今天我們從凍干菌種的復蘇確認、質控菌種的保藏和使用、菌種管理要求、菌種接收和登記四個方面為大家詳解實驗室質控菌種保藏、使用及管理。
一、凍干菌株的復蘇確認
1、圖解凍干菌株復蘇具體操作
準備開啟復蘇凍干菌種的所有實驗用品：酒精燈、75%消毒酒精棉、移液槍、接種環、培養基、凍干菌種（注意：所有操作應在符合生物安全保護及無菌條件下進行）
開啟凍干菌種西林瓶時，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。
然后，在無菌條件下，按鋁蓋上的箭頭方向打開塑蓋，撕開鋁蓋，打開西林瓶膠塞。
用移液槍向凍干質控菌種西林瓶加入0.3ml左右的配套液體培養基，水化凍干粉，將凍干質控菌種溶解成為均勻的懸液。
用移液槍吸取適量凍干粉水化懸液，移至適合其生長的斜面、平板或液體培養基上。
或者，用接種環蘸取適量凍干粉水化懸液。
接種斜面
或平板劃線接種（便于觀察菌落形態）
接種完后，在器皿上標記菌種編號、傳代數、日期等信息。
倒置放進恒溫培養箱培養。
最后，將轉接的斜面或平板以及西林瓶里剩余的菌懸液放置于36°C培養箱中進行培養
次日，觀察菌種的生長情況，如未生長，應繼續培養24H，或吸取西林瓶里的懸液再次接種斜面或平板培養基，培養24H觀察。
2、凍干菌株復蘇補充說明
1）志賀氏菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、粘質沙雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、芽孢桿菌類、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌：復蘇水化液為腦心浸液培養基，復蘇培養基為營養瓊脂，復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
2）糞鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌：復蘇水化液為腦心浸液培養基，復蘇培養基為血平板，復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
3）VB0非01群霍亂弧菌：復蘇水化液為堿性蛋白胨水，復蘇培養基為堿性瓊脂，復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
4）副溶血性弧菌、創傷弧菌：復蘇水化液為3％NaCl堿性蛋白胨水，充分懸浮后放置于37±1℃下復蘇8-12小時；再轉接培養基為3％NaCl營養瓊脂，培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
注意事項：
由于副溶血性弧菌、創傷弧菌對低溫比較敏感，在凍干保存過程中菌量數級下降，因此需要先增菌后轉接，否則會復蘇失敗。
5）單核細胞增生李斯特氏菌：復蘇水化液為腦心浸液培養基，復蘇培養基為血平板或胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA－YE），復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
6）生孢梭菌、產氣莢膜梭菌：復蘇水化液為腦心浸液培養基，復蘇培養基為皰肉牛肉粒肉湯加液體石蠟1cm（隔絕空氣營造厭氧環境），復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
7）空腸彎曲菌：復蘇水化液為布氏肉湯，復蘇培養基為血平板，復蘇培養條件42±1℃微需氧條件下培養48－72h。
8）兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌：復蘇水化液為TPY肉湯，復蘇培養基為BBL瓊脂，復蘇培養條件42±1℃厭氧環境下培養48－72h。
9）德氏保加利亞乳桿菌：復蘇水化液為MSR肉湯，復蘇培養基為脫脂奶粉溶液（10%），復蘇培養條件37±1℃培養基培養24h-48h。
10）黑曲霉、桔青霉、繩狀青霉、白色念珠菌、啤酒酵母：復蘇水化液為沙氏液體培養基，復蘇培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），復蘇培養條件25－28℃培養基培養2-5天。
溫馨提示：
? 凍干菌株復蘇需要一個最適生長環境，復蘇培養基不能選用選擇性培養基或顯色培養基，這些培養基里面含有抑菌成分不利于菌株復蘇。
? 凍干菌種為一次性使用品，開啟之后不能反復使用或保存，暫不開啟的菌種應在4℃保藏。
3、菌株純度檢查和確認
菌落形態：單菌落在分離平板上的特征
細胞形態：鏡檢
芽胞大小、位置、性狀
生化鑒定
如有雜菌污染，需劃線分純。
二、質控菌種的保藏和使用
1、質控菌株的使用
1）定量菌液制備（比濁法）
? 將純度滿意的新鮮培養物懸浮滅菌生理鹽水中；
? 以滅菌生理鹽水調整、制備成0.5麥氏（McFarland)濁度的菌懸液，備用；
? 使用時稀釋至合適的稀釋度。
2）麥氏（McFarland)比濁標準管的配制
例如，需配大約100cfu/mL 的細菌菌液濃度：
? 無菌操作用接種環挑取測試細菌的純培養物到盛有一定量無菌生理鹽水管中，混懸。
? 以比色卡作為背景目測，直到濁度與0.5 麥氏比濁標準管的濁度相一致，如右圖所示。
? 0.5 號麥氏濁度標準管相當于1×10^8CFU/mL 濃度，以此為參照值，取1mL 濁度跟0.5 號麥氏濁度標準管相一致的菌懸液到9mL 無菌生理鹽水管中，作10 倍梯度稀釋10^7、10^6、10^5……，10^2 稀釋度含菌量大約為100cfu/mL。
注：
1）測試菌的純培養物可以是凍干菌株復蘇后純培養物。
2）本法僅供細菌液濃度的粗略計算。
2、菌種的保存
? 確定適宜的保藏方法。
? 同一菌株應選用兩種或以上方法進行保藏。
? 只能用一種方法保存的菌株應備份存放于兩個以上保藏設備中。
? 菌種入庫和出庫應記錄入檔。
? 重要菌種應異地保存備份。
3、菌種保存方法
1）傳代培養法：復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養。保藏時間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉一次，普通細菌1個月轉一次，假單胞菌2周轉一次。
2）液體石蠟法：將無菌石蠟加在長菌的斜面或半固體上，高出斜面頂端1cm為準，隔絕空氣，試管直立，置于低溫或室溫保存。芽孢、霉菌、酵母菌保存2年，普通細菌1個月至1年。
3）甘油凍存法：將復活后經過性能確認的菌株新鮮培養物（一般是第二代菌株），用0.85%的滅菌生理鹽水（約1-2ml）洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管（凍存管）中（如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌
液），加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。
4）瓷珠保存管保存：菌株保藏管內含特制的小珠（20-25顆）和特殊溶液，只需將培養好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。
瓷珠保存管保存具體操作：
第一步：對需要保存的菌株進行必要的純化，挑取生長旺盛時期的菌落，接入菌株
保藏管中，通常需要接入4-7環，對于苛養菌應多接一些；
第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；
第三步：用無菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；
第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存（推薦使用-70℃超低溫冰箱）；
第五步：復蘇時，只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養。
注：
1. 盡可能避免反復凍融，對于一些苛養菌和厭氧菌這樣做可能會影響保存效果；
2. 很多情況下，復蘇須對菌株純度檢查，必要時做生化鑒定，以確認無污染。
瓷珠法保存操作：
瓷珠保存后活化操作：
三、菌種管理要求
? 實驗室的裝備和管理：防護水平與操作對象危險程度相適應
? 制定菌種使用、保藏管理制度和標準化操作規程菌種申購、保管、領用、使用、傳代、存儲等，確保溯源性和穩定性
? 建立文件記錄，做好紙質和數字化信息檔案備份菌名、編號、來源、鑒定特征、鑒定者、傳代情況、最適培養基和培養條件、保藏方法和保藏位置等
? 保藏菌種容器表面貼上標簽
? 保存菌株應制備成儲備菌株和工作菌株，定期傳代，每次傳代至少對菌種進行形態學觀察
? 菌種管理專人負責：菌種保藏、復核鑒定和使用管理
四、菌種接收和登記
? 獲得途徑：購買、交換、接收贈送。
? 來源：專門的菌種保藏機構，如美國典型培養物保藏中心（ATCC）菌株或商業來源的ATCC演化菌株。
? 記錄菌株號、菌名、來源、數量、生產日期、接收日期等信息。
