支原體的培養法檢測詳細介紹！
發布時間：2023-12-06 瀏覽次數：1479
支原體是細胞培養過程中常見的外源性污染物，對于生物制品生產企業來說，支原體污染是非常嚴重的問題，給生物制品帶來難以估量的安全隱患。因此，開展支原體檢查是細胞質量控制微生物學安全性評價體系中的一項重要內容。針對支原體對細胞培養帶來的巨大不良影響，在中國藥典、美國藥典、歐洲藥典和日本藥典中都要求，對主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批以及病毒疫苗等執行支原體檢查。
01 目前有哪些常見的檢測方法？
常見的支原體檢測方法
培養法和指示細胞培養法則是被各國藥典普遍認可的、用于生物制藥的質控的支原體檢測方法。然而，培養法所使用的培養基并不能適用所有的支原體生長，存在一定的局限性，同樣指示細胞培養法對于一些胞質吸附能力較弱的支原體檢出也會存在一定的局限性。因此，藥典中要求對支原體檢測需要兩種方法共同檢測，以確保支原體檢出的效力。
02 直接培養法
《中華人民共和國藥典》規定的支原體檢測方法培養法和指示細胞培養法（DNA染色法）是檢測支原體的“金標準”，能夠檢測不同生長特性的支原體。下面我們詳細介紹一下直接培養法。
1) 不同培養基
由于支原體DNA中缺少編碼中間代謝產物的基因, 支原體的能量代謝系統比較簡單，因此支原體具有“營養缺陷”的特點，許多重要代謝途徑受阻，如三羧酸循環、糖異生等。這使得支原體生長對營養的需求比一般細菌要高，生長所需的營養成分主要從外界攝取，除需要含有碳源、氨基酸、無機鹽等基礎營養物質外，還需加入人或動物血清，以提供支原體生長、繁殖所必需的膽固醇和脂肪酸。
● 根據支原體是分解葡萄糖還是利用精氨酸，支原體培養基可以分為2類，即葡萄糖發酵型和精氨酸水解型。解脲支原體雖然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素。
● 根據培養基中是否有瓊脂及其含量又可分為液體、半流體與固體培養基。
2) 不同培養法
● 液體培養基培養法：在富含葡萄糖的支原體肉湯培養基中，支原體分解葡萄糖產生酸性物質，從而使液體培養基pH值下降為酸性，顏色變黃；精氨酸支原體肉湯培養基pH值為堿性，支原體生長可分解尿素，產生氨，會使得pH進一步變高，培養基顏色變為桃紅色，提示有支原體生長；
● 半流體培養基培養法：在半流體培養基中如觀察到沿接種線呈煙霧狀，則提示有支原體生長；
● 固體培養基培養法：在固體瓊脂培養基上，可觀察到支原體形成經典的“油煎荷包蛋”式的菌落，通過觀察菌落形態以判斷是否存在支原體污染。
操作規范的情況下，直接培養法不容易出現假陰性結果，檢測精確度很高，因此被譽為支原體檢測金標準。缺點是檢測周期太長，支原體要長出明顯克隆至少需要28天時間，對于放行周期要求比較苛刻的生物制品如CAR-T細胞治療產品，該方法會帶來實際應用上的挑戰。
03 直接培養法的特點
優點：在選用合適培養基以及合規要求操作下，很少會出現假陰性結果，檢測精確度很高，因此被譽為支原體檢測金標準。
缺點：操作時間太長，至少28天才能出結果，滿足不了大多數質檢部門的要求。無法檢測出死亡的支原體。
來源：環凱轉載于“ 恒馭生物 ”公眾號，作者~海芋。
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