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標準簡介

現行有效的GB4789.2-2022是在2022年12月30號開始實施，在2022年6月30號發布的，與2016版相比，此版標準在檢驗程序上沒有太大的變化，培養基和試劑方面新增了一個菌落總數測試片。

標準解讀

檢驗菌種類：需氧情況下，37℃培養48h，能在普通營養瓊脂平板上生長的細菌。不含厭氧或微需氧菌、有特殊營養要求的以及非嗜中溫的細菌。也不包括真菌，真菌有單獨的檢驗方法。
菌落總測定是用于判定食品被細菌污染的程度和衛生質量，反應食品在生產過程中是否符合衛生要求。

3  設備和材料
      除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

3.1 恒溫培養箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

主要為細菌的培養提供恒定的溫度
36℃是非水產類產品的培養溫度，30℃是水產類的培養溫度

3.2 冰箱：2℃~5℃。

用于試劑及菌株的保存

3.3 恒溫裝置：48℃±2℃。

用于對已滅菌但未用的固體培養基的保溫（在此標準上指PCA，在大腸菌群標準上指結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）
溫度可以在46℃～50℃之間，只要用時溫度合適就行
2016版水浴裝置：46℃±1℃，2022版修改為恒溫裝置，這就表示還可以用其他的恒溫設備保存，例如恒溫干燥箱。

3.4 天平：感量為0.1g。

稱取培養基及樣品稱取，需單獨兩個天平，一個放準備室，一個放無菌室。

3.5 均質器。

對待檢試樣液的均質，使試樣液的菌含量保持一致，包括勻漿機和拍打式均質器，勻漿機涉及到固體非粉末狀樣品，拍打式均質器適用于除固體非粉末狀樣品外的樣品

3.6 振蕩器。

與均質器作用相仿

3.7 無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

用于試液轉移，微量移液器需定期檢定和滅菌，一次性吸頭需濕熱滅菌處理后烘干水分再使用（買一份移液槍能解放雙手喲，就是耗材用得多）

3.8 無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。

盛裝培養基及試樣液，試樣液可用均質袋替代

3.9 無菌培養皿：直徑90mm。

玻璃培養皿滅菌需放入金屬滅菌桶后選用恒溫干燥箱171℃滅菌3小時及以上，一次性塑料無菌培養皿拆包裝前需紫外殺菌15min以上（有些玻璃培養皿因材質問題，用久會發黃，不影響使用）

3.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

僅用于自配培養基的pH調節，商用培養基基本上不需要調節pH值

3.11 放大鏡或/和菌落計數器。

用于培養后的培養基進行菌落計數

加一個試管和配套試管塞（尺寸15*150mm）

用于盛裝9mL稀釋液，試管和試管塞需要濕熱滅菌處理

4  培養基和試劑

4.1 平板計數瓊脂培養基

主要培養基，成分適合細菌進行繁殖
如果是檢一批五個樣品，大概需要9.4gPCA+400mL水滅菌（以五個樣品兩個稀釋度二十個平板+兩個空白對照計算，每個平皿倒15-18mL培養基，用到330mL～396mL。倒培養基倒少了需注意保持培養箱的濕度，不然培養基會裂給你看）

4.2 菌落總數測試片

應符合GB4789.28中平板計數瓊脂培養基質量控制要求,且主要營養成分與平板計數瓊脂培養基配方一致。

4.3 磷酸鹽緩沖液

成分較無菌生理鹽水更科學合理，磷酸鹽可在適宜范圍內調節試樣液本身pH，降低因樣品本身的pH對實驗造成影響，適用于酸類、堿類和高鹽類樣品的菌落計數。用前需濕熱滅菌121℃持續15min（推薦用）

4.4 無菌生理鹽水

較磷酸鹽緩沖液優勢為更易配制。用前需濕熱滅菌121℃持續15min
如果是檢一批五個樣品，大概需要稱11.9g氯化鈉+1400mL水溶解分裝（以225mL五個樣品+9mL試管計算，1400mL能配5瓶225mL 0.85%生理鹽水和30管9mL 0.85%生理鹽水稀釋液，能做到-6或-7梯度）磷酸鹽緩沖液同理

5  檢驗程序

菌落總數的檢驗程序見圖1。

6  操作步驟

除樣品外所有操作需要使用的試劑耗材，必須滅菌，設備設施可采用紫外殺菌及75%濃度酒精擦拭后使用

6.1  樣品的稀釋

6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min~10000r/min均質1min~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min~2min，制成1∶10的樣品勻液。

25g樣品：精確到0.1g，偏差25+0.2g，盡量不要偏差太大，可多不可少。
在標準無規定的情況下，最好按25g稱樣進行實驗，這符合GB 4789.1中對抽樣遵循代表性原則。當稱樣數量越少，代表性越差。
225mL稀釋液：可使用滅菌后的量筒量取，也可以配制分裝好后滅菌直接用（比滅菌后量取劣勢為水分滅菌易揮發，導致稀釋液濃度改變）。用哪種可自由選擇，但特殊樣品（酸類、堿類、高鹽類）盡量使用磷酸鹽緩沖液，避免樣品本身pH造成實驗誤差。
均質器拍打：固體樣品可選用均質器均質，使樣液混勻；速溶類樣品可不用均質器。
1:10樣品勻液：1mL樣液→9mL試管稀釋液=10mL勻液，樣液加入后可使用無菌吸管吹打（盡量不用，減少污染），也可搖勻，盡量使液體保持在試管口以下。

6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

無菌玻璃珠：用于混勻樣液與緩沖液

6.1.3 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。

沿管壁緩慢注：可能在管壁殘留細菌，需要震搖試管，將管壁上的試液混合于勻液中。若使用無菌吸頭，可直接垂直于試管將試液打入稀釋液中，不靠試管壁，吸頭不入液面。
在樣品菌落數范圍未知/無法通過以往樣品判斷菌落數范圍時，應多做幾個稀釋度。

6.1.4 按6.1.3操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。

盡量避免稀釋梯度之間的污染

6.1.5 根據對樣品污染狀況的估計，選擇1個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。

根據以往的樣品大概的菌含量預估樣品的菌含量，適當選擇2個~3個稀釋梯度，可以選擇2個稀釋梯度，但必須有1個至2個梯度的菌含量在范圍內
例：-1（皿1 皿2） -2（皿1 皿2） 空白（皿1 皿2）

6.1.6 及時將15mL~20mL冷卻至46℃~50℃的平板計數瓊脂培養基(可放置于48℃±2℃恒溫裝置如：恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。

平板計數瓊脂培養基溫度需適宜，以不燙手為宜（水浴箱中拿出的培養基溫度適中，可直接使用，無需冷卻）。
有些樣品為避免白色食物殘渣在計數時的影響，會在PCA中加入TTC（各大培養基廠商有售無菌TTC溶液），使培養后的菌落呈紅色。此項適用于食物殘渣中含白色物質。
轉動平皿使其混合均勻：平皿保持同方向，手拿平皿邊緣按前后運動、左右運動、順時針混勻，禁止培養基因大力轉動造成溢出，培養基冷凝后方可倒置平皿培養。
本標準未規定稱取至倒培養基的過程時間，一旦樣品過多，盡量保持在20min之內。（標準沒寫，GB 4789.3中大腸菌群操作時間是15min，為的是避免過程中因時間過長導致細菌繁殖）

6.2  培養

6.2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養48h±2h。水產品30℃±1℃培養72h±3h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基(約4mL)，凝固后翻轉平板，按6.2.1條件進行培養。

倒置平皿培養，溫度36℃±1℃，記錄溫度時需準確，不出現±符號。一般培養箱檢定時會提供一個偏差值，需要在原有溫度基礎上修正偏差量
水產品培養溫度比正常的樣品要低，主要原因是水產品長期處于水中，生長環境溫度較低。

6.2.2 如使用菌落總數測試片,應按照測試片所提供的相關技術規程操作。

6.3  菌落計數

6.3.1 可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits，CFU)表示。

CFU指單個培養皿的菌落個數。

6.3.2  選取菌落數在30 CFU~300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

6.3.3 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。

6.3.4 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

7  結果與報告

7.1 菌落總數的計算方法

7.1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。

7.1.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式(1)計算：

7.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數均＜30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

7.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數均＞300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。

7.1.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。

7.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分＜30CFU 或＞300CFU 時,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

7.2 菌落總數的報告

7.2.1 菌落數小于100CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數報告。

菌落數指計算后的結果，即公式（1）中的N
例如計算結果為35CFU/(g)mL，則報35CFU/(g)mL，不需要再修約。

7.2.2 菌落數大于或等于100CFU 時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用 0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。

例如計算結果為3540，則報3500CFU/(g)mL或3.5×103CFU/(g)mL

7.2.3 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。

空白對照長菌，證明環境/試劑/工具有污染。
此條可理解為當空白對照沒長菌落時，可以用“未檢出”表示

7.2.4 稱重取樣以 CFU/g為單位報告,體積取樣以 CFU/mL為單位報告。

附錄A
培養基和試劑

A.1 平板計數瓊脂(platecountagar,PCA)培養基

A.1.2 制法

將上述成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調節 pH 至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶,121 ℃高壓滅菌 15min。

有商品化脫水培養基，不用自行調節pH，可直接使用，有效避免自配產生的誤差。
其中樣品為白色或偏白色時，培養基中可添加1%的無菌TTC進行菌落著色，著色后菌落為紅色。
煮沸溶解：適用于自配培養基，商品化脫水培養基可不進行此操作（滅菌前需分裝的培養基除外）

A.2 磷酸鹽緩沖液

貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶 液調節pH 至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。

A.2.2 制法
稀釋液：取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓滅菌15min。

有商品化脫水培養基，直接使用，有效避免自配產生的誤差。

A.3 無菌生理鹽水

A.3.2 制法
稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15min。 

菌落總數原始記錄參考模板

參考資料：
1. GB 4789.2-2022 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定
2.中華人民共和國衛生健康委員會官網
3.T/LZZLXH 033-2020 實驗室產品檢測全流程記錄管理指南
4.DB51/T 2163-2016 實驗室樣品記錄及檢測記錄管理指南
5.微生物檢驗方法食品安全國家標準實操指南
6.《寒煙脆》公眾號文章（2022年4月30日）