嬰兒奶粉中乳酸菌活細胞快速檢測的進步：基于FCM法
發布時間：2024-08-26 瀏覽次數：272
乳酸菌：調節人體腸道菌群無形的手
乳酸菌是一類能將糖類發酵生成乳酸的益生菌，廣泛存在于乳制品、發酵食品以及人體的消化道和生殖道中。它們在食品工業中常用于發酵酸奶、奶酪等產品。乳酸菌可以調節腸道菌群、促進消化吸收并增強免疫：如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌可以治療嬰兒腸痛，因此在醫學和營養學領域受到廣泛關注。乳酸菌檢測對于評估食品安全性、保證產品質量以及維護腸道健康至關重要。
FCM法：乳酸菌檢測的主要操盤手
FCM法（Fluorescence Correlation Microscopy，熒光相關顯微鏡法）是一種基于熒光標記的顯微技術，用于分析分子在溶液中的動態行為。通過檢測熒光分子的熒光強度隨時間的變化，FCM法可以提供分子濃度、擴散速度、相互作用等信息，廣泛應用于生物化學和生物物理學研究。由于過去開發的LAMP，MALDI-TOF-MS法等或多或少都存在一些缺陷——如無法定量、時間成本高等，并且單獨的FCM法不具有特異性，因此FCM法聯用PMA和FISH便被開發出來。
1+1>2:多種生物技術的聯用煥發的勃勃生機
對樣品預處理后，使用PMA對活細胞進行染色，再利用特異性熒光探針（FISH）對活菌細胞進行熒光標記（該熒光探針為RNA探針LAB 158用于乳酸桿菌細胞的特異性染色）。通過固定步驟使用固定液(PFA)和透化劑改變樣本通透性，進而進行雜交步驟，最后在流式細胞儀488nm處進行分析，乳桿菌細胞的定量則通過平板法測定實現。
排除艱難險阻：核心問題的優化
使用FISH方法必須越過的大山有一座，那就是采用增強探針的信號等手段優化染色過程提升雜交強度，目前總共有五大類手段來解決這一問題：一是提高探針濃度，此方法中對樣品采用了消化處理，以消化其中的蛋白質和脂肪減少了雜質的數量，并且將乳酸菌細胞暴露于CHI這種廣譜抗生素中以增加細胞rRNA含量。二是優化雜交條件，通常FISH方法的雜交溫度為37°C到42°C之間，并且可以通過延長雜交時間來增強信號。該方法首先在不同雜交溫度(36、38、40、42、44、46和48°C)下使用最終濃度約為109cells/mL的乳桿菌細胞懸液進行預實驗最終確定了雜交溫度為42°C時，相對FL強度最高，并輔以CHI。三是使用信號放大系統，常用的放大技術為TSA（Tyramide Signal Amplification），它利用辣根過氧化物酶（HRP）催化酚類化合物的聚合反應，將多個熒光分子沉積在探針結合的部位，從而顯著增強信號，本方法使用的CHI亦是同理。四是使用更亮的熒光染料，如Alexa Fluor系列染料，比傳統的FITC、TRITC等染料具有更高的熒光強度和光穩定性。五是減少背景噪聲，通過調整洗滌液的鹽濃度和溫度去除未結合的探針和非特異性結合物或者在雜交前使用封閉劑（如牛血清白蛋白，BSA）處理樣本，阻斷非特異性結合位點，降低背景信號。在解決完這些核心問題之后，該方法被進行了活乳桿菌細胞定量的驗證，并具有較好的特異性。PMA- Serfish -FCM法的TTR總計近2.5 h，其中預處理20 min, PMA染色10 min，寡核苷酸探針染色115 min, FCM分析5 min，新方法的TTR比傳統的方法要短得多。
結論：該項研究提供了一種全新的嬰兒配方奶粉質量檢測思路，通過三種生物技術的結合有效增強了奶粉中活乳酸菌細胞檢測特異性，提高了準確性并減少了時間成本，這一方法為乳酸菌活菌的檢測手段提供了新的思路和可能性。但它也存在一些不足，如FCM技術所需的經濟成本較高，手段較為繁瑣。
原文doi：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03742
來源：微生物安全與健康網，作者~雷曉旭
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