稀釋涂布平板法計數微生物的四大誤區
發布時間：2024-10-08 瀏覽次數：2035
今天要跟大家分享的是一篇關于平板菌落計數的文獻，雖然這篇文章更多的是針對應試的，但是個人覺得對于我們在工作和科研實驗中的實際操作也是挺有用的。特別是對單位換算，樣品稀釋操作不是很清楚的小伙伴應該會有一定幫助。
稀釋涂布平板法計數微生物的計算公式為：
每克樣品中的菌株數 ＝ （Ｃ ÷ Ｖ） × Ｍ，Ｃ 代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，Ｖ 代表涂布平板時所用稀釋液的體積，Ｍ 代表稀釋倍數。
誤區1 對平均菌落數的理解
公式中的 Ｃ 不一定是所有實驗所得菌落數的平均值。 為增強實驗說服力和減小實驗誤差，實驗需設置對照實驗和重復實驗。若空白對照有菌，說明實驗可能被污染，相當于質控不在控，這種情況下不能將平板菌落數去平均值，而是需要分析可能污染的原因并重新進行實驗。
重復實驗是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布３個平板（一般設置３—５ 個平板），選擇菌落數在 30—300 的平板計算平均菌落數。若重復實驗中某個平板的菌落數與其他差別甚遠，如四個平板的菌落數分別為 42、200、256、234，菌落數42與其他數值差異過大，說明該平板操作過程有誤，則該菌落數應舍棄。 若舍棄后不足三個平板，不能用菌落數相近的兩個平板取平均值，應找到原因并重做實驗。 若計算每克樣品中的某種菌株數，則 Ｃ應代表某一稀釋度下平板上生長的符合該菌菌落特征的菌落數的平均值，培養基上其他菌種形成的菌落數不能一并計算在內。 如檢測１L待測水樣中的大腸桿菌數目只統計大腸桿菌菌落數的平均值。
誤區二 對稀釋倍數的判定
平板中菌落數過少會導致計數誤差過大，菌落數過多又會造成計數困難，為確保有效活菌數的準確測定，應合理設定稀釋倍數。待測樣品中微生物數量越多，所需稀釋倍數越大，而微生物數量越少，所需稀釋倍數越小。
如測定土壤中細菌數量，一般選用１０４、１０５和 １０６ 倍稀釋；測定放線菌數量，一般選用１０３、１０４和 １０５倍稀釋；測定真菌數量，一般選用 １０２、 １０３和 １０４倍稀釋；測定自來水中大腸桿菌數量，一般不稀釋，直接進行涂布培養。
圖源：人教版高中生物教材
誤區三 對體積與質量的單位換算
微生物計算公式中的 Ｖ 代表涂布平板時所用稀釋液的體積，通常為0.1 ｍＬ，但若待測樣品中微生物數目較少，接種0.1mL經培養后平板上菌落數達不到30，可增大接種量（如接種 １ ｍＬ）。
1cm3=1000μＬ=1mL=0.001L
體積和質量的換算公式是：體積 ＝ 質量÷ 密度（Ｖ ＝ ｍ／ ρ），水的密度是 １ ｇ／ cm3，則質量為１g的水的體積是 １ cm3即１ｍＬ。
誤區四 對統計誤差的分析
從稀釋涂布平板計數的原理分析，運用該方法統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，因為樣品一般不易完全分散成單個細胞，當兩個或多個活細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。從稀釋涂布平板計數的過程分析，稀釋倍數是否合適、涂布是否均勻、培養環境是否能保證微生物正常生長、計數是否存在漏計或重復計數等情況都會影響統計結果。 除此之外，還要考慮培養時間對菌落數目的影響，菌落數目需要每隔一段時間統計一次，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，防止因培養時間不足遺漏菌落的數目。
知其然，還要知其所以然。
參考文獻：張艷娟,陳兆亮,郭建坤.稀釋涂布平板法計數微生物的四大誤區[J].中學生理科應試,2024,(04):52-53.
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