甘油菌種復蘇保存步驟與注意事項
發布時間：2024-11-01 瀏覽次數：2102
在微生物學研究及其工業應用中，甘油菌種的復蘇和保存尤為重要。甘油作為一種常用的保護劑，具有出色的維持菌種活性和穩定性的能力。這一特點使其在微生物保存過程中得到了廣泛應用。然而，復蘇和保存的細節及注意事項直接影響菌種的存活率以及后續實驗的成功與否。因此，熟悉甘油菌種復蘇和保存的正確步驟與關鍵注意事項，對于檢測人員來說，具有重要的現實意義。
首先，甘油菌種的保存通常采用低溫冷凍的方法。將菌種與一定比例的甘油混合后，迅速冷凍至-80℃或更低的溫度，以確保菌種在低溫下的長期穩定性。在這個過程中，甘油的濃度、混合均勻性以及冷凍速度都是影響保存效果的重要因素。
其次，菌種的復蘇過程同樣需要精心操作。復蘇時，應將冷凍的菌種迅速解凍，并在適宜的培養基中進行培養。解凍過程中，溫度的控制和時間的把握至關重要，過快或過慢的解凍速度都可能導致菌種的損傷。此外，復蘇后的菌種應盡快轉移到新鮮的培養基中，以恢復其生長活性。
在整個復蘇和保存過程中，還需要注意無菌操作，避免外界污染對菌種的影響。同時，定期檢查保存的菌種，確保其活性和純度，也是保證實驗結果可靠性的關鍵。
1.甘油菌種復蘇保存步驟
甘油菌種的復蘇保存是一個關鍵的過程，需要經歷幾個重要步驟。首先，在菌種保存階段，應將菌種接種于LB液體培養基，并在培養體系內渾濁可見時進行保存。接著，要準備50%濃度的甘油溶液，確保在無菌條件下將菌液與甘油按1:1的比例混合，使甘油終濃度達到25%，然后保存在-20°C冰箱內。
如果需要長期保存，建議在-70°C或-80°C下凍存。在菌種復蘇階段，需要在30°C水浴中解凍保存的菌種，并接種到固體培養基上，在適宜條件下培養以恢復菌種的活性。最后，再次保存時，復蘇后的菌種可以在新的液體培養基中繼續培養，并進行甘油保存，以確保菌種的長期保存和可用性。
在整個過程中需要注意的是，確保所有使用的工具和容器都經過適當的滅菌處理，保持無菌條件，以避免污染。正確的保存和復蘇方法對于保持菌種的活性和純度至關重要，且保存溫度對菌種的長期存活有顯著影響，低溫有利于延長保存時間。
甘油菌種的復蘇和保存的詳細的步驟及注意事項：
① 菌種保存步驟
準備培養基：將菌種接種于LB液體培養基中，并在對數生長期（培養體系內渾濁可見時）進行保存。
制備甘油溶液：準備50%濃度的甘油溶液，可以通過等體積的蒸餾水和甘油混合得到。
混合菌液和甘油：在無菌條件下，將菌液與50%濃度的甘油按1:1的比例混合，使甘油終濃度達到25%。
保存菌種：將混合液轉移至2mL離心管中，并在-20°C冰箱內保存。這種條件下，菌種的保存有效期為1年。若需長期保存，建議在-70°C或-80°C下凍存，保藏時間一般為2-4年。
② 菌種復蘇步驟
解凍：在使用前，將保存的菌種在30°C水浴中解凍。
接種培養：解凍后，將菌液接種到固體培養基上，并在適宜條件下培養24-48小時，以恢復菌種的活性。
再次保存：復蘇后的菌種可以在新的液體培養基中繼續培養，并再次進行甘油保存。這一過程確保了菌種的長期保存和可用性。
③ 注意事項
選擇合適的培養基：勿使用選擇性培養基。一般使用非選擇性的增菌培養基，因為微生物在選擇性培養基中生長某些生物特性可能丟失，保藏的菌種的生物特性可能與標準菌株特性不同。
菌液的濃度：菌液的濃度一般越大，菌種保存時間越長。保藏時細菌常使用菌液，霉菌常用無菌水或生理鹽水制備成的孢子懸液。
甘油濃度：甘油終濃度一般為10%~20%。由于甘油原液太粘稠，需要配制合適的甘油-水溶液，將菌懸液與甘油以1:1的體積比充分混勻后，分裝至提前滅菌好的保藏管中，-80℃（-70℃）冰箱保存。
反復使用：對菌種進行保藏時注意“慢凍快化”，冷凍時降溫速率保持1℃/min,復蘇時用37℃水浴融化，能夠保證菌種最大的成活率。當冷凍菌種融化后，應避免再次冷凍，否則菌體的生存率會大幅度降低。
保存時間：該方法適合中長期菌種保藏，保藏時間一般為2-4年左右。
核查驗證：每半年進行一次菌種確認試驗，通過平板劃線分離、觀察菌落形態、染色鏡檢等常規實驗檢測細菌的存活情況。若有條件，可用菌株生化鑒定試劑盒進行確認。
保存的溫度對菌種的長期存活有很大影響，低溫條件有利于延長保存時間。
文章來源：環凱轉載于“食品微生物檢測”公眾號；
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