真菌菌種保存全攻略：方法、步驟與注意事項
發布時間：2025-02-07 瀏覽次數：691
真菌是一類多樣性豐富的微生物，隨著保存時間的延長和不斷的傳代需要，真菌的毒力、致病性、生長速度等基本特性會發生改變。為了最大限度保持真菌的活性、形態學、生理學、遺傳完整性等特性，往往需要幾種培養和保存方法。理想情況下，保存的菌種在長期保存下仍具有活性，但處于靜止狀態，以防突變的積累導致形本學和生化特性的改變。常用的菌種保存方法有持續傳代，保存于無菌水、土壤或礦物油中，冷凍或真空干燥等。
持續傳代法是將真菌持續地在瓊脂上接種生長，是一種短期的保存方法。將培養物存放于4~25℃ 或將其冷凍可以增加傳代的間隔。將真菌保存于無菌水放置在室溫是一種簡易經濟的方法，但真菌細胞的穩定性無法得到保障。利用冷凍法，如液氮或低溫(一20℃和-80℃)可以較好地彌補水保存法的不足。國際上的一些真菌研究機構推薦使用冷凍法和凍干法進行菌種保存。盡管對活細胞進行凍干可以長期保證細胞的穩定性，但整個程序冗長耗時，且需要昂貴的設備。因此冷凍法的使用最為廣泛，大多數真菌可使用此法進行保存。
一、水保存法
1）操作步驟
1、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養基，置于25℃培養2周，向培養管內加入6~7ml 的無菌蒸餾水。
2、使用移液器槍頭在斜面上輕輕刮取孢子或菌絲片段，收集上清懸液并轉移至無菌的帶螺口瓶內。
3、將瓶蓋旋緊，以防止水分的蒸發，如發生蒸發可定期添加無菌蒸餾水，在瓶上做好標記儲存于室溫。
2）活性檢測：無菌條件下從瓶內吸取0.3ml懸液接種至SDA或PDA斜面，于25℃培養3周，定期觀察生長情況3周后如無生長，或重復轉種培養后仍無生長，表明保種物無活性。
二、冷凍保存法
1）操作步驟：
1、將真菌接種在帶螺口蓋的聚丙烯管PDA斜面培養基，置于25℃培養2周。
2、旋緊瓶蓋，置于冷凍冰箱(-20℃以下) 。
2）活性檢測：從冰箱取出培養管，自冰凍的PDA斜面挖取一小部分菌落接種至另一PDA斜面培養基，于25 ℃培養至少3周。如復蘇生長的菌落特點與保種之前的特性一致，表明保種切實可行；如轉種的菌落無生長或菌落的特性與初始特性不一致，按上述方法重復轉種。如第二次轉種仍無生長表明保種失敗。
注意：培養管自冰箱取出后應盡快操作，避免融化，盡快放回冰箱，否則影響真菌的存活率。
三、礦物油浸沒法
1）操作步驟：
1、準備高等級的礦物油，121℃高壓15min。
2、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養基，置于25℃培養2周。
3、向培養管內加入礦物油，以礦物油高出斜面1cm為宜，確保培養管的斜面和所有菌落完全被浸沒。
4、將培養管直立放置于室溫，定期觀察礦物油水平及含量，必要時適量添加。
2）活性檢測：從保種培養斜面挑取小量菌落接種至適當的培養基(PDA或SDA),取菌時盡量瀝去礦物油。由于菌落黏附礦物油，菌落的生長速度會較慢，可能需要傳代多次。理想的操作方法可以將菌落接種在斜面培養基的中點，可以使多余的礦物油流至管底。
四、冷凍干燥法
冷凍干燥保存適合產孢的真菌，特別是一些能夠產生子囊孢子和分生孢子的真菌，保存周期長，可達20~40年。
1）操作步驟：
1、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養基，置于25℃培養至生長良好。
2、刮取適量真菌與保護劑(如脫脂牛奶)混勻后，加入安瓿瓶中，在一40℃冰箱預冷2h。
3、置于冷凍干燥機上冷凍干燥8~20h，熔封。
4、測定真空度，合格后2-8℃保存。
2）活性檢測：配制液體SGA或者MEA培養基，安瓿瓶打開后將粉末倒入以上培養基，適宜條件下生長1~3周， 保存良好的菌落可以恢復生長。
| 方法 | 保護劑 | 溫度 | 保存年限 | 特殊設備 | 優點 | 不足 |
| 持續 培養法 | 無 | 4-25℃ | 1~2年 | 不需要 | 簡便 | 耗費人力， 時間有污袋的風險， 穩定性低 |
| 蒸餾水 保存法 | 無 | 室溫 | 1~10 年 | 不需要 | 簡便 | 需要有經驗的人員 |
| 礦物油 保存法 | 無 | 室溫 | 1~40年 | 不需要 | 簡便 | 保存期同繼續生長， 穩定性低 |
| 液氮 保存法 | 甘油， DMSO | -180 一 -130℃ | >40年 | 需要 | 長期穩定 ，省時 | 需要有經驗的人員， 費用昂貴 |
| 凍干法 | 甘油， DMSO， 脫脂牛奶 | 2-8℃ | 5~40年 | 需要 | 長期穩定 | 需要有經驗的人員， 耗時，費用昂貴 |
| 低溫 冷凍法 | 營養培養 基甘油 | -80 一 -20℃ | 5~30年 | 需要 | 簡便， 長期穩定 | 需要冷凍冰箱， 不太適合皮膚癬菌 |
