大腸桿菌是引發(fā)多種水傳播疾病的主要原因，世界衛(wèi)生組織已將水中大腸桿菌含量作為評(píng)估糞便污染的主要指標(biāo)。目前常用的平板計(jì)數(shù)法和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）雖靈敏度高，但操作繁瑣、耗時(shí)久且需專業(yè)設(shè)備，在資源有限地區(qū)難以推廣。酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)結(jié)合比色法具有操作簡單、快速直觀、無需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)勢，且與智能手機(jī)結(jié)合后更適用于資源受限地區(qū)，但傳統(tǒng)納米酶存在依賴不穩(wěn)定的H 2O2 、對反應(yīng)溫度和 pH 要求苛刻等問題。
研究團(tuán)隊(duì)合成了具有 pH 適應(yīng)性的CuO2作為光響應(yīng)氧化酶，它在光照下能通過光生空穴直接氧化 3,3,5,5 - 四甲基聯(lián)苯胺（TMB），避免了對酸性 pH 的依賴，在中性條件下也能保持良好的催化活性，同時(shí)還能維持 β - 半乳糖苷酶（β - gal）的最佳活性。噬菌體作為特異性細(xì)菌識(shí)別劑，能選擇性識(shí)別大腸桿菌并促進(jìn) β - gal 快速釋放，提升檢測靈敏度。二者結(jié)合構(gòu)建的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，可實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的高效檢測。
圖 1：展示CuO2 合成過程及相關(guān)表征，證明其成功制備。
圖 2：探究 pH 對CuO2酶活性影響及光響應(yīng)氧化酶活性機(jī)制。
圖 3：研究β?gal/CuO2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)檢測大腸桿菌的可行性與選擇性。
實(shí)驗(yàn)中，研究人員先將大腸桿菌與噬菌體孵育，離心獲取含 β - gal 的上清液，再加入 p - 氨基苯基 β - D - 吡喃半乳糖苷（PAPG）和CuO2 ，反應(yīng)一段時(shí)間后加入 TMB 并光照，最后加H2SO4終止反應(yīng)。通過紫外 - 可見分光光度計(jì)分析 450nm 處氧化型 TMB（Ox - TMB）的吸收峰，或利用智能手機(jī) RGB 顏色識(shí)別技術(shù)，即可檢測大腸桿菌濃度。該方法檢測限低至15CFU/mL，能準(zhǔn)確測量低至102CFU/mL的大腸桿菌濃度，回收率在 95.0% - 104.1% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.3% - 2.8%。同時(shí)，該方法可區(qū)分活死大腸桿菌，減少假陽性和假陰性結(jié)果。結(jié)合智能手機(jī)的比色傳感檢測，不僅操作便捷，檢測限更是低至13CFU/mL 。此外，CuO2作為光響應(yīng)氧化酶在 4°C 儲(chǔ)存 7 天仍能保持高活性，檢測方法的重現(xiàn)性良好。
圖 4：觀察噬菌體感染大腸桿菌過程及 β - 半乳糖苷酶釋放差異。
圖 5：評(píng)估生物傳感器檢測大腸桿菌的特異性及區(qū)分活死菌能力。
圖 6：測試CuO2穩(wěn)定性和檢測方法對大腸桿菌檢測的重現(xiàn)性。
該研究揭示了CuO2的新型光氧化酶特性，并將其與噬菌體特異性相結(jié)合，開發(fā)出高效的大腸桿菌檢測方法。此方法在資源受限環(huán)境中具有巨大應(yīng)用潛力，有望成為水質(zhì)監(jiān)測和食品安全保障的有力工具。
參考文獻(xiàn)：Zeng Q, Deng T, Yang Y, et al. pH-Adaptable CuO2 Photo-responsive Oxidase with Phage-Lysed β-galactosidase Based Cascade Reaction for Colorimetric Detection of Escherichia coli in Drinking Water with High Specificity and Sensitivity[J]. Journal of Hazardous Materials, 2025: 138295.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~徐禮龍。
