微生物斜面菌種接種與培養操作指南！
發布時間：2025-05-13 瀏覽次數：384
一、操作流程
1. 準備工作
標記試管
用油性記號筆在斜面試管外壁標注：菌種名稱、接種日期、操作者姓名（避免使用易脫落的標簽）。
若使用預滅菌試管，檢查封口是否完好，避免污染。
無菌環境準備
用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面、雙手及工具表面。
點燃酒精燈，操作區域限制在火焰周圍10-15cm范圍內（無菌區）。
準備菌種管和空白斜面試管，左手持兩管，斜面朝上呈30°角（菌種管在前，便于快速操作）。
2. 工具滅菌與試管處理
接種工具滅菌
右手持接種環（針），將金屬部分垂直置于酒精燈外焰燒至紅熱（持續3-5秒），冷卻后使用。
注意：若使用帶塑料柄的接種環，避免火焰直接接觸塑料部分。
松動棉塞：在火焰旁輕輕旋轉兩試管的棉塞，使其易于快速拔出。
3. 取菌與接種操作
試管口滅菌：左手持兩試管，右手小指與無名指夾住棉塞拔出，試管口短暫過火焰（2-3秒）滅菌。
取菌技巧
冷卻后的接種環輕觸菌種管空白培養基區域（如無冷凝水，可輕觸內壁降溫）。
挑取單菌落邊緣菌苔（避免挑取過厚或老化的菌體），動作輕快，防止高溫損傷菌種。
劃線接種
接種環與斜面角度：40°-45°
劃線力度：輕觸表面，避免劃破瓊脂（劃痕可能導致雜菌滋生）。
劃線密度：若需單菌落，采用四區劃線法（每區后灼燒接種環）。
將菌種轉移至空白斜面，從底部向管口方向劃“Z”形線（如圖示）。
關鍵參數：
4. 封管與工具處理
封管滅菌
接種后試管口再次過火焰，迅速塞緊棉塞（避免火焰燒焦棉塞）。
若使用硅膠塞或螺旋蓋，需在火焰旁旋緊。
工具二次滅菌：接種環先在火焰上灼燒至殘留菌體碳化（防止飛濺），再徹底燒紅滅菌。
5. 培養條件
溫度與時間
| 微生物類型 | 培養溫度 | 培養時間 |
|---|---|---|
普通細菌 | 37℃ | 18-24小時 |
真菌（如霉菌） | 25-30℃ | 3-5天 |
嗜熱菌 | 55-60℃ | 24-48小時 |
其他參數
濕度：保持培養箱濕度60-70%（防止培養基脫水）。
避光：對光敏感的菌種需用錫箔紙包裹試管。
二、關鍵注意事項與問題解決
1. 無菌操作核心原則
三不原則：
棉塞不碰桌面（始終夾在手指間）。
試管口不對空氣開放（火焰旁操作）。
滅菌工具不接觸未滅菌表面。
污染應急處理：若發現培養基渾濁或異味，立即高壓滅菌（121℃, 20分鐘）后丟棄。
2. 常見問題與優化
| 問題現象 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
斜面無生長 | 接種環溫度過高燙死菌種 | 冷卻時間延長至5-8秒 |
雜菌污染 | 試管口未充分滅菌 | 試管口過火時間延長至5秒 |
劃線不均勻 | 接種環角度或力度不穩定 | 練習模擬劃線（未接種時訓練手感） |
培養基開裂 | 瓊脂濃度過低或脫水 | 調整瓊脂濃度至1.5-2.0% |
3. 特殊菌種操作
厭氧菌：使用厭氧罐或抽換氣系統，培養基中添加還原劑（如半胱氨酸）。
病原菌：在生物安全柜中操作，穿戴防護服及手套，廢棄物需高壓滅菌。
三、操作后管理
菌種保存：
短期保存：4℃冷藏，普通細菌可存活1-3個月。
長期保存：甘油凍存管（-80℃）或真空冷凍干燥。
記錄與標記：詳細記錄菌種傳代次數、培養基批次及培養結果。
通過嚴格執行上述步驟，可顯著提高斜面接種成功率，減少污染風險，為后續實驗提供可靠菌種來源。
