研究背景：克雷伯氏肺炎桿菌是一種廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中的致病菌，它能夠引起包括肺炎在內(nèi)的多種嚴(yán)重感染，尤其在免疫力低下的患者中更是致命的威脅。隨著抗生素耐藥性的不斷增加，快速準(zhǔn)確地診斷克雷伯氏肺炎桿菌感染變得尤為重要，這對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、控制感染的傳播、減少醫(yī)療成本以及提高患者生存率都有顯著影響。而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法耗時(shí)或需昂貴的儀器和熟練的操作員，限制了在臨床即時(shí)快速檢測(cè)方面的應(yīng)用。基于 CRISPR的檢測(cè)方法逐漸發(fā)展，具有高靈敏度、方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。近期，北京化工大學(xué)史碩博教授等構(gòu)建了一種用于樣品提取的快速室溫前處理方法，并改進(jìn)了基于 Cas12a 的技術(shù)，以開發(fā)一種免提取的一鍋法病原體檢測(cè)方法，并在Biosensors and Bioelectronics上進(jìn)行發(fā)表。
EXORCA檢測(cè)流程：
該檢測(cè)試劑盒只需兩個(gè)步驟即可檢測(cè)臨床樣品：快速預(yù)處理（約1 min）和 RPA/Cas12a 檢測(cè)（約30 min）。預(yù)處理主要是將裂解液與樣本呢混勻。隨后，混合物直接進(jìn)行 RPA/Cas12a 檢測(cè)。使用次優(yōu) PAM 的 crRNA 由于 Cas12a 的活性降低而具有較慢的 CRISPR 檢測(cè)動(dòng)力學(xué)，從而使反應(yīng)偏向等溫?cái)U(kuò)增。隨后，RPA 產(chǎn)生足夠的擴(kuò)增子，可以被 Cas12a/crRNA 二元復(fù)合物識(shí)別，這反過來促進(jìn) Cas12a 的反式切割反應(yīng)。這種活性導(dǎo)致 ssDNA 熒光探針的切割，從猝滅劑中分離熒光團(tuán)，從而發(fā)射熒光信號(hào)。
檢測(cè)效果：
如下圖所示，通過熒光讀數(shù)器獲取結(jié)果的方法的檢測(cè)范圍在10-1-10-7CFU/μL，而通過肉眼直接在藍(lán)光下觀察獲取檢測(cè)結(jié)果的方法的檢出限大概在10-1CFU/μL 。而且該檢測(cè)方法具有良好的特異性，對(duì)于不同的克雷伯氏肺炎桿菌均能達(dá)到較好的響應(yīng)，而對(duì)于非克雷伯氏肺炎桿菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌等常見的致病菌），均呈現(xiàn)陰性結(jié)果。并且研究人員設(shè)計(jì)了這幾種菌的 crRNA 序列使用EXORCA的方法進(jìn)行檢測(cè)，均得到了較好的檢測(cè)結(jié)果。這些結(jié)果說明了該方法具有良好的靈敏度、特異性、便捷性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于臨床即時(shí)檢測(cè)提供了新方法和新思路。
論文來源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116740
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~賀鵬霖。
