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一、蠟樣芽孢桿菌檢驗的衛生學意義
芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，革蘭氏陽性大桿菌。
● 在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多食品中常見
● 已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、醬油、布丁、米飯及各種甜點。
● 1950年首次在挪威明確報告其致病作用
? 引起食物中毒的原因－腸毒素
部分菌株能產生腸毒素，有致嘔吐型和腹瀉型兩類。
◆ 腹瀉毒素：大分子量蛋白質，引發腹瀉型綜合癥,能在各種食物中形成；
◆ 嘔吐毒素：小分子量、熱穩定多肽，100℃ 30min不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素，常在米飯中形成。
臨床表現：
◆ 腹瀉型：潛伏期為8h～16h，主要癥狀為水瀉、腹痛、腹痙攣為主，病程約24h。
◆ 嘔吐型：潛伏期為0.5h～5h，癥狀以惡心、嘔吐為主，病程不超過24h。
? 蠟樣芽胞桿菌食物中毒特征
● 以夏季（6-10月）為主
● 致病因子為細菌繁殖過程中產生的細菌毒素
● 中毒食品含菌量在10的6次方CFU/g(ml)以上
● 引起中毒的原因常為食品食前保存溫度不當，放置時間較長或食品加熱不當
● 美國 炒米飯
● 歐洲 甜點、肉餅、色拉、奶和肉制品
● 中國 米飯、淀粉類制品
二、蠟樣芽孢桿菌的生物學特性
兼性好氧。生長溫度范圍20～45℃菌落較大，干燥，灰白色，不透明，圓形，凸起，表面粗糙似磨砂玻璃或融蠟狀，中等擴散。
10℃以下生長緩慢或不生長。50℃時不生長。
在100℃下加熱20min可破壞這類菌。
三、蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法
? 蠟樣芽孢平板計數法檢驗程序流程
01) 樣品的處理
◆ 稱取25 g樣品至盛有225 mL磷酸緩沖液或0.85%生理鹽水的無菌均質杯內，8000 r/min-10000 r/min均質1min-2min，或放入盛有225 mL 稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min-2 min，制成1:10樣品勻液。
02) 液體的稀釋
◆ 用1 mL的無菌吸管或微量移液器吸收1：10樣品勻液1 mL，加到盛有9 mL磷酸鹽緩沖液或0.85%生理鹽水的試管中，充分混勻，制成1：100的樣品勻液。
◆ 按上一步操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，直至適宜稀釋倍數
03) 樣品的接種
◆ 選擇2-3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），單個平行實驗中分別吸取0.3 mL、 0.3 mL、 0.4 mL的樣品勻液加入MYP瓊脂平板，一個稀釋梯度兩個平行（共6個板），然后用無菌L棒均勻涂布于整個平板。
04) 分離培養
在通常情況下，涂布之后將平皿靜置10-30min，待樣品勻液吸收后翻轉平板，30℃ ± 1℃培養24h。如果培養物的菌落特征不顯著，則繼續培養至48h。
從符合計數要求的毎個平板中至少挑取5個典型菌落（小于5個全選），劃線接種于營養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。
蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生長的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，在深紅色背景下呈現粉紅色或微粉紅色，環繞產生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環。沒有根狀生長特性（蕈狀芽孢桿菌形成根狀生長特征）。
| 酚紅為pH指示劑；發酵D—甘露醇產酸使菌落顯黃色；卵黃含有卵磷脂，蠟樣芽孢桿菌產生卵磷脂酶，在菌落周圍產生沉淀環；多粘菌素B可抑制雜菌的生長。 |  |
 |  |
| MYP瓊脂平板劃線接種蠟樣芽孢桿菌 | MYP瓊脂平板涂布接種蠟樣芽孢桿菌 |
| MYP瓊脂平板接種蠟樣芽孢桿菌：微粉紅色（表示不利用甘露醇），周圍有白色至淡粉色沉淀環（表示產卵磷脂酶） | |
蠟樣芽孢顯色培養基
 |
| 蠟樣芽孢桿菌在蠟樣芽孢顯色培養基平板上生長的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，中心藍綠色，環繞產生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環。 |
05) 生化鑒定
接種生化鑒定培養基后36±1℃培養18-24h結果
◆ 生化試驗：溶菌酶耐性、甘露醇、葡萄糖（厭氧）、淀粉水解、硝酸鹽還原、VP試驗、明膠、動力、西蒙氏檸檬酸鹽。
革蘭氏染色
◆ 從每個平板上挑取5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，分別接種于營養瓊脂斜面或平板，30℃ ± 1℃培養24 h,取培養物進行革蘭氏染色和證實試驗。
1、葡萄糖發酵試驗
將培養物接種到糖發酵管中，置于厭氧培養箱中36℃ ± 1℃培養24 h，震蕩后肉湯由紅變黃，表明在厭氧條件下蠟樣芽孢桿菌分解葡萄糖。（也可用液體石蠟形成厭氧環境）。
2、硝酸鹽還原實驗
將培養物接種到硝酸鹽肉湯中，36℃ ± 1℃培養24 h后，加0.25 mL亞硝酸鹽試劑A和0.25 mL亞硝酸鹽試劑 B，在10 min內變為紅色為陽性反應。
3、V-P實驗
將培養物接種到改良V-P培養基中，36℃ ± 1℃培養48h或72h后，2ml培養基中添加1mL 5% α-萘酚乙醇溶液，后加入0.4 mL 40% KOH溶液，靜置15min出現伊紅粉紅色為陽性。（注意1：必須在有氧的情況下反應，所以必須充分震搖。2：試劑順序不能顛倒，可能產生假陽性）
4、酪蛋白分解實驗
將培養物接種到酪蛋白瓊脂培養基上，36℃ ± 1℃培養48 h，在靠近菌生長的地方培養基為透明的，則表明酪氨酸倍分解，陰性則繼續培養至72 h，結果仍為陰性的棄去。
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| 酪蛋白分解試驗 | 溶血試驗 |
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| 酪蛋白瓊脂平板 | 血平板 |
| 劃線接種蠟樣芽孢桿菌：菌落周圍培養基出現澄清透明區（表示產生酪蛋白酶） | 劃線接種蠟樣芽孢桿菌：淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有完全溶血環 |
5、溶菌酶實驗
將培養物接種到0.001%溶菌酶營養肉湯中，另取培養物接種到普通營養肉湯中作對照，36℃ ± 1℃培養24 h，蠟樣芽孢桿菌在本培養基中生長，為陽性反應。如出現陰性反應繼續培養24 h,結果仍為陰性棄去。
6、觸酶試驗
在潔凈的平皿內滴加3%過氧化氫溶液2滴，用牙簽或一次性接種環挑取新鮮培養物放在平皿內過氧化氫溶液中，如果半分鐘內發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性。
7、根狀實驗
挑取單個可疑菌落劃平行直線于經室溫干燥1d～2d的營養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h～48h，不能超過72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽胞桿菌呈粗糙山谷狀生長的特征。
8、動力試驗
用接種針挑取培養物穿刺接種于半固體培養基中，30℃ ± 1℃培養24 h。有動力的蠟樣芽孢桿菌沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽孢桿菌常呈絨毛狀生長。
9、溶血試驗
將疑似菌點種胰酪胨大豆羊血瓊脂平板TSSB，30℃ ± 1℃培養24 h。有動力的蠟樣芽孢桿菌會觀察到的β-溶血反應。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌呈現弱的溶血現象，而炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。
10、蛋白質毒素結晶試驗
06) 計數方法
選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在20 CFU～200CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果出現a）~f）現象按公式（1）計算，如果出現g）現象則按公式（2）計算；
a）只有一個稀釋度的平板菌落數在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）2 個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間，但只有一個稀釋度的平板有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c）所有稀釋度的平板菌落數均小于20 CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度的平板菌落數大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數均大于200 CFU且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；
f）所有稀釋度的平板菌落數均不在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU時，應計數最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落；
g）2 個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間且均有典型菌落。
公式一：
 | T----樣品中金黃色葡萄球菌菌落數； A---某一稀釋度典型菌落的總數； B---某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數； C---某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數； d---稀釋因子。 |
公式二：
 |
| T --- 樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數; A1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數; B1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數; C1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數; A2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數; B2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數; C2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數; 1.1 --- 計算系數; d --- 稀釋因子(第一稀釋度)。 |
07) 結果與報告
根據MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數，按4.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。
必要時報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結果。
08) 計算范例
