隨著現代醫學及相關科學技術的發展，各學科相互交叉和滲透，醫學微生物學檢驗技術已深入到細胞、分子和基因水平，許多新技術、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛應用。醫學微生物學實驗室的基本任務之一是利用微生物學檢驗技術，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進行耐藥性監測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學調查及研究等提供科學依據。

微生物形態學檢查

  細菌形態學檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類和鑒定的基礎，可根據其形態、結構和染色反應性等，為進一步鑒定提供參考依據。

一、顯微鏡檢查

  由于細菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態和結構可用光學顯微鏡觀察，其內部的超微結構則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。

1.普通光學顯微鏡

  采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4μm。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即0.2μm，而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油(浸)鏡放大1 000倍，能將0.2μm的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學顯微鏡可用于細菌、放線菌和真菌等的觀察。

2.暗視野顯微鏡

  常用于觀察不染色微生物形態和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細菌或螺旋體等。

3.相差顯微鏡

  相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉換為光強度差。在相差顯微鏡下，當光線透過不染色標本時，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態、內部結構和運動方式等。

4.熒光顯微鏡

  熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡基本相同，主要區別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發出紫外光或藍紫光。濾光片有激發濾光片和吸收濾光片二種。用藍光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結合的細菌的檢測或鑒定。

5.電子顯微鏡

  用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學放大系統，放大倍數可達數萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細菌超微結構的觀察。

二、不染色標本檢查

  不染色標本一般可用于觀察細菌形態、動力及運動情況。細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環境的不同來進行觀察。有鞭毛的細菌運動活潑，無鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。

1.懸滴法

  在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環取一環菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下(或暗視野)觀察。

2.壓滴法

  用接種環取一環菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數秒鐘后置高倍鏡下明視野(或暗視野)觀察。

3.毛細管法

三、染色標本檢查

  細菌標本經染色后，由于細菌與周圍環境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學顯微鏡下可清楚地觀察到細菌的形態特征(如細菌的大小、形狀、排列等)和某些特殊結構(如莢膜、鞭毛、芽孢等)，并可根據染色反應性對細菌加以分類鑒定。

(一)細菌染色的一般程序

  細菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復染)。

1.涂片制備

  血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。

2.固定

  目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色;促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉;改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

  根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。

4.媒染

  凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

  凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。

6.復染

  已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。

  主要用于厭養菌動力的檢查。通常選用60~70mm長。0.5~1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。

(二)常用染色法

1.單染色法

  只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀察細菌的大小、形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。

2.復染色法

  用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

  (1)革蘭染色：①細菌涂片經火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

  (2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①細菌涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。持續染5min(奴卡菌需要加長時間)，水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。

  金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。

3.特殊染色法

  (1)鞭毛染色(改良Ryu法)：①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餾水1滴。③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果 鞭毛和菌體呈紫色。

  (2)異染顆粒染色(阿爾培托法)：①細菌涂片經火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

  (3)莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。

  (4)芽胞染色：染液：第一液為萋-納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。

4.負染色法

  背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5.熒光染色法

  經熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發出熒光。

微生物培養與分離方法

  大多數細菌均可以通過人工方法培養，而衣原體和病毒的分離培養往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。只有將微生物培養出來才能對它進行研究、鑒定和應用。

一、接種與分離方法

  根據待檢標本的性質、培養目的和所用培養基的種類，采用不同的接種方法。

1.平板劃線分離培養法

  對混有多種細菌的臨床標本，采用劃線分離和培養，使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線分離目的菌。平板劃線分離法通常有兩種方法：

  (1)分區劃線分離法：此法常用于含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分離。先用接種環挑取標本涂布于瓊脂平板1區(占培養基總面積的?)并作數條劃線，再于2、3、4區依次劃線。每劃完一個區域，均將接種環燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區域，每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板，培養后分別觀察1區形成菌苔，2區菌落連成線，3區和4區可分離到單個菌落。

  (2)連續劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

2.瓊脂斜面接種法

  主要用于菌落的移種，以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環(針)挑取單個菌落或培養物，從培養基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

3.穿刺接種法

  此法多用于半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種，半固體培養基的穿刺接種可用于觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4.液體培養基接種法

  用于各種液體培養基如肉湯、蛋白胨水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落，傾斜液體培養管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體淹沒接種物為準)。此接種法應避免接種環與液體過多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實驗室污染。

5.傾注平板法

  本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內，混勻，待凝固后置37℃培養，長出菌落后進行菌落計數，以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格(每格為1cm2)中菌落數，求出每格的平均菌落數，并算出平皿直徑，然后按下列公式計數，求出每毫升標本中的細菌數。

  全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2

  每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數

6.涂布接種法

  本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養，本法經培養后細菌形成菌苔。

二、細菌的培養方法

  根據不同的標本及不同的培養目的，可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。

1.需氧培養

  是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養，將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h，無特殊要求的細菌均可生長。少數生長緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內保持一定的濕度，可在其內放置一杯水。對培養時間較長的培養基，接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培養基干裂。

2.二氧化碳培養

  某些細菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養，特別是在初次分離時，須在5%~10 %二氧化碳環境中培養才能生長。常用的培養法如下。

  (1)二氧化碳培養箱法：二氧化碳孵箱能自動調節二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養物置于孵育箱內閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結果。

  (2)燭缸培養法：取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養基放入缸內，點燃蠟燭后放在缸內稍高于培養物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少，數分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內孵育。

  (3)氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養皿放入袋內，盡量祛除袋內空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態，執斷袋內已置的二氧化碳產氣管(安瓿)產生二氧化碳，數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環境，置于35℃孵育箱內孵育。

  (4)化學法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內，連同容器置于玻璃缸內，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內孵育。

3.微需氧培養

  微需氧菌培養在大氣中及絕對無氧環境中均不能生長，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中才可生長，將標本接種到培養基上，置于上述氣體環境中，35℃進行培養即微需氧培養法。

4.厭氧培養

  厭氧菌對氧敏感，培養過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環境。厭氧培養常用的方法有：物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。

三、細菌在培養基上生長特性

1.固體培養基

  標本或液體培養物劃線接種到固體培養基表面后，單個細菌經分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團，稱為菌落(colony)。

  (1)菌落的形態特征：大小、形狀(露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等)、突起或扁平、凹陷、邊緣(光滑、波形、鋸齒狀、卷發狀等)、顏色(紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和粘度等。據細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型： ①光滑型菌落(S型菌落)：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落(R型菌落)：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質形成。R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。③粘液型菌落(M型菌落)：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結核桿菌等。

  (2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養基出現1~2mm的草綠色環，為高鐵血紅蛋白所致;②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環，是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致;③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養基沒有變化，紅細胞沒有溶解或缺損。(3)色素：有些細菌產生水溶性色素，使菌落和周圍的培養基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產生的色素有水溶性或脂溶性。

  (4)氣味：某些細菌在培養基中生長繁殖后可產生特殊氣味，如銅綠假單胞菌(生姜氣味)、變形桿菌(巧克力燒焦的臭味)、厭氧梭菌(腐敗的惡臭味)、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線菌(泥土味)等。

2.液體培養基

  細菌在液體培養基中有3種生長現象：大多數細菌在液體培養基生長繁殖后呈均勻混濁;少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長;枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

3.半固體培養基

  半固體培養基主要用于細菌動力試驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。